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Jul 12, 2023

Uso del submarino de imágenes moteadas

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 2613 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

El crecimiento de la colonia microbiana es impulsado por la actividad de las células ubicadas en los bordes de la colonia. Sin embargo, este proceso no es visible a menos que se realice una tinción específica o un corte transversal de la colonia. La tecnología de imagen moteada es un método no invasivo que permite la visualización de las zonas de mayor actividad microbiana dentro de la colonia. En este estudio, se utilizó la técnica de formación de imágenes con láser moteado para registrar el crecimiento de las colonias microbianas. Este método se probó en tres microorganismos diferentes: Vibrio natriegens, Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Los resultados mostraron que el sistema de análisis de manchas no solo puede registrar el crecimiento de la colonia microbiana, sino también visualizar la actividad de crecimiento microbiano en diferentes partes de la colonia. La técnica de imagen moteada desarrollada visualiza la zona de "la mayor actividad microbiana" migrando desde el centro hacia la periferia de la colonia. Los resultados confirman la precisión de los modelos anteriores de crecimiento de colonias y proporcionan algoritmos para el análisis de la actividad microbiana dentro de la colonia.

El crecimiento del tamaño de la colonia se utiliza como criterio para caracterizar la actividad microbiana en medios de agar. El crecimiento del tamaño de las colonias generalmente se controla mediante la grabación de imágenes en vivo en diferentes momentos y la comparación de los tamaños de las colonias. Al adoptar esta técnica de imagen, las imágenes se obtienen mediante cámaras de alta resolución o escáneres planos1,2. El tiempo de detección crítico, el tamaño de la colonia, la tasa de crecimiento y el tamaño máximo de la colonia son los parámetros que pueden cuantificarse utilizando los métodos de imágenes en vivo existentes.

Existen varios modelos que describen el crecimiento de colonias3,4,5. En muchos modelos, el crecimiento de colonias microbianas se describe como desigual: el crecimiento de colonias depende de las zonas activas de los microbios que, a su vez, dependen del suministro de nutrientes del medio. Por ejemplo, el crecimiento microbiano en el borde de la colonia es más activo que en su centro debido al suministro constante de nutrientes de los medios circundantes o al empuje constante de las células sobre los laterales. La estructura microscópica de la colonia respalda muchas de estas suposiciones. Las células en el centro de la colonia de levaduras dejan de proliferar y pierden viabilidad mientras que las células en el borde de la misma colonia están vivas y continúan creciendo (proliferando)6. Las diferencias en la actividad microbiana en diferentes partes de la colonia no se pueden visualizar con precisión con los métodos de imágenes en vivo existentes. Actualmente, las diferentes actividades microbianas dentro de las colonias solo se pueden explorar con procedimientos invasivos: corte transversal de colonias y tinción de viabilidad6.

Un patrón de interferencia creado por la luz coherente reflejada o dispersada desde diferentes partes de la superficie iluminada es un moteado láser. Si un objeto que se irradia con motas de láser no cambia las propiedades de dispersión con el tiempo, la imagen de motas tampoco cambiaría. Si los dispersores se mueven espontáneamente (p. ej., movimiento browniano), algunas motas comienzan a cambiar (forma, intensidad). El cambio en las propiedades de dispersión de los objetos crea un moteado variable en el tiempo. Es decir, los eventos o influencias externas, así como los procesos que ocurren directamente en la superficie medida, pueden provocar cambios en las imágenes de motas7. Con respecto a este fenómeno, la técnica de formación de imágenes de moteado láser ha resultado útil para controlar la actividad microbiana en medios ópticamente no homogéneos mediante el análisis de patrones de moteado láser variables en el tiempo.

La técnica de obtención de imágenes por láser moteado es una tecnología emergente para los análisis médicos y de seguridad alimentaria. Permite la detección temprana del crecimiento microbiano8, la identificación de infecciones fúngicas en manzanas9 y la medición del flujo sanguíneo periférico en pacientes con esclerosis10.

En este estudio, se utilizó la técnica de formación de imágenes de motas para registrar el crecimiento y las características estructurales de la colonia microbiana. Los resultados mostraron que el sistema de análisis de motas desarrollado es capaz no solo de registrar el crecimiento de una colonia microbiana sino también de visualizar la actividad de crecimiento microbiano en las diferentes partes de la colonia. La proyección de imagen de motas revela que el crecimiento de la colonia es impulsado por la proliferación celular en sus bordes en lugar de su centro. Los resultados confirman la precisión de los modelos anteriores de crecimiento de colonias y proporcionan algoritmos para los análisis de actividad microbiana dentro de la colonia.

En los experimentos se utilizaron las siguientes cepas microbianas: Escherichia coli ATCC® 8739 (E. coli), Vibrio natriegens DSM 759 (V. natriegens) y Staphylococcus aureus ATCC® 6538P (S. aureus). Los cultivos bacterianos se mantuvieron en placas de agar. E. coli y S. aureus se mantuvieron en medios de agar LB que consistían en Bacto Peptone 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, agar 20 g/l (todo Biolife, Italia) y NaCl 5 g/l (Sigma, Alemania). V. natriegens se mantuvo a temperatura ambiente en caldo de sal NB agarizado: Difco Nutrient Broth 8 g/l, NaCl 15 g/l, según lo sugerido por Weinstock et al.11.

Todas las especies microbianas se subcultivaron a partir de una única colonia en los respectivos medios líquidos y se cultivaron a +30 °C durante la noche. Las placas de Petri se inocularon con cultivo bacteriano diluido en serie para producir de 20 a 200 colonias por placa. Las placas de Petri con bacterias inoculadas se colocaron a + 30 °C en una incubadora (Herracell 240-i, Thermo Scientific). El crecimiento de colonias se controló en paralelo mediante iluminación láser de 635 nm (ver descripción en "Sistema experimental para capturar imágenes de motas láser e imágenes bajo iluminación de banda ancha") y mediante un escáner de documentos de superficie plana (CanoScan 4400f, Canon). Se garantizó el escaneo automático de placas después de cada intervalo de 15 o 30 minutos mediante la ejecución de la aplicación Auto Clicker. La resolución de las imágenes fue de 600 DPI.

El sistema experimental de imágenes de motas láser se ensambló para capturar imágenes a escala macro con luz LED blanca e iluminación láser roja. El sistema consta de una fuente láser multimodo, una fuente de luz LED blanca, una lente con montura C de 35 mm @F18, un atenuador óptico, una placa de agar de prueba (con bacterias inoculadas) y una cámara CMOS (Fig. 1). Las motas de láser se generaron mediante un láser de estado sólido bombeado por diodo multimodo de 635 nm polarizado linealmente (potencia de salida de hasta 300 mW) con una longitud de coherencia de 30 cm. El atenuador óptico se utilizó para lograr la exposición óptima para la captura de imágenes y evitar los efectos de calentamiento de la placa iluminada, lo que permitió una densidad de potencia de 3–5 mW/cm2 de la luz láser dispersada en toda la superficie de la placa de agar. El diámetro del rayo láser en la superficie fue superior a 9 cm, proporcionando una iluminación uniforme de toda la placa de Petri estándar. Los componentes principales del sistema se presentan en la Fig. 1. Las imágenes moteadas fueron capturadas por una cámara CMOS a intervalos de 30 s para experimentos con diferentes duraciones (25–70 h). El tiempo de exposición se fijó en 1 s; se eligió de acuerdo con la iluminación láser y el diafragma de la lente. Los parámetros de la configuración óptica, incluida la resolución de la cámara, el diafragma de la lente, la distancia de la cámara a la placa de Petri y la región de interés resultante, se eligieron para lograr una resolución espacial adecuada para detectar motas láser. El aumento de la lente se fijó en 0,2. El valor de diafragma de F18 se eligió como el equilibrio óptimo entre la nitidez de la imagen, el tamaño de las manchas y la exposición requerida. Eso da como resultado una resolución espacial de 9 μm y un tamaño de punto de 33 μm.

Experimente el flujo de trabajo para la captura de imágenes moteadas durante el crecimiento de bacterias. (A) Inoculación de una sola colonia en un medio LB y cultivo durante la noche (+30 °C). (B) Dilución e inoculación del cultivo durante la noche en medio LB agarizado. (C) Crecimiento de colonias en placas de agar en termostato + 30 °C con captura de imagen moteada con láser de 635 nm y escáner de superficie plana. D Procesado de imágenes y análisis de datos (entorno MATLAB): detección de tamaño de colonia, velocidad de crecimiento, filtración de señal de speckle, identificación de migración de speckle, etc.

En los estudios anteriores, los autores describieron un análisis subpíxel de correlación sensible, que puede ayudar a detectar la actividad bacteriana y sus efectos dentro de una colonia8,12. Todo el campo del experimento (placa de Petri) se dividió en pequeñas secciones de N × N píxeles. Los pasos a continuación se realizaron para cada sección por separado. Se realizó una correlación cruzada normalizada bidimensional entre imágenes consecutivas de N × N píxeles desde el principio hasta el final del experimento13:

donde a(x,y) y b(x,y) son dos cuadros adyacentes en la secuencia, \(\overline{a}\) y \(\overline{b}\) son los valores promedio de estos dos cuadros, u y v son desplazamientos espaciales entre los marcos a(x,y) yb(x,y) hacia xey, respectivamente.

Era necesario averiguar el desplazamiento exacto del pico de correlación cruzada. Este valor caracteriza los cambios que ocurren entre imágenes consecutivas de NxN píxeles:

Para encontrar un valor más preciso del desplazamiento, la interpolación parabólica se realizó alrededor del pico de la función de correlación cruzada14:

donde \({a}_{u}\) y \({b}_{u}\) son los coeficientes parabólicos.

Las compensaciones obtenidas entre cada par de imágenes de NxN píxeles adyacentes se acumularon desde el principio hasta el final del experimento:

Ejecutar el algoritmo descrito para imágenes consecutivas de N × N píxeles para toda la secuencia crea una "señal de tiempo".

Este algoritmo se implementó para todas las secciones de N × N píxeles en todo el campo del experimento. Por lo tanto, se obtuvo una matriz bidimensional de las "señales de tiempo", donde el tiempo es la tercera dimensión, en lugar del campo considerado del experimento.

Para encontrar los extremos locales y evitar la influencia de picos transitorios locales, es conveniente suavizar la señal15. Se utilizó la función de envolvente de señal (Fig. 2). Se puede utilizar una técnica de raíz cuadrada media móvil u otro algoritmo similar para este propósito:

donde N es la longitud de la ventana, n es la muestra actual, k es el índice que se ejecuta dentro de la ventana. En consecuencia, N, la longitud de la ventana, es responsable del grado de suavizado de la señal. Para evitar outliers al realizar la técnica RMS, se pueden truncar los valores extremos, como se hace adoptando la técnica de media truncada16.

Arriba a la izquierda: La señal obtenida usando el algoritmo (azul) y su envolvente (rojo). (Señal del centro de la colonia). La línea verde indica el tiempo de máxima actividad. La figura muestra una señal de una colonia de S. aureus. También se observó un patrón de señal de moteado similar para E. coli y V. natriegens. Abajo a la izquierda: Un espectrograma es una representación de una señal en un dominio de tiempo-frecuencia utilizando una transformada de Fourier de tiempo corto (STFT), que permite observar simultáneamente el comportamiento de la señal y el ruido en el tiempo y la frecuencia. Lado derecho: el ruido (fuera de la colonia) obtenido mediante el algoritmo (arriba) y el espectrograma de ruido (abajo).

En la Fig. 2, también es posible comparar la señal (dentro de la colonia) y el ruido (fuera de la colonia) tanto en el dominio del tiempo como en el de la frecuencia. La señal es mucho más alta que el nivel de ruido.

En primer lugar, se probó si el sistema de imágenes de motas láser establecido no afectaba el crecimiento de colonias microbianas. Para verificar esto, el radio de crecimiento de la colonia estimado por el sistema de moteado láser se comparó con los resultados obtenidos usando el método de referencia, un sistema de imágenes de escáner de superficie plana muy reconocido. Para este propósito, los microorganismos se subcultivaron de una sola colonia durante la noche, se diluyeron en serie y luego se inocularon en una placa de Petri para observar la formación de colonias a partir de una sola célula (aprox. 20–200 colonias por placa) o se aplicaron puntos de diluciones en serie en la placa. placas y así obtener macrocolonias. Se cultivaron micro y macrocolonias en un medio de agar en la misma incubadora en paralelo bajo un sistema de formación de imágenes de motas y en el escáner de superficie plana (Canon Canoscan4400r). Se registró el crecimiento de colonias de V. Natriegens, E. coli y S. aureus y se analizaron sus patrones de motas mediante un algoritmo de correlación de subpíxeles (descrito en "Algoritmo de la conversión de imágenes de motas en señales de tiempo"). Los resultados se presentan en la figura 3.

Dinámica del radio de crecimiento de la colonia a lo largo del tiempo. Los radios de las colonias de E. coli, V. natriegens y S. aureus se midieron mediante análisis de imagen de motas láser (azul) o considerando imágenes tomadas con un escáner de superficie plana (Canon 4400, 600 DPI) (rojo).

Comparando el crecimiento de las colonias probadas, se obtuvieron resultados muy similares con ambos sistemas. Por lo tanto, se puede concluir que el sistema de moteado láser establecido no afecta el crecimiento de colonias microbianas (ver Fig. 3). Comparamos la tasa de crecimiento radial de las colonias microbianas cultivadas con un dispositivo de imágenes de motas y dentro de un escáner de superficie plana y la tasa de crecimiento radial no difirió significativamente (prueba t, p> 0.05), consulte la Tabla complementaria 1.

Además, se analizó si la señal moteada de la colonia en crecimiento se correlaciona con el número de células de la colonia. El tiempo del valor máximo de la señal de las imágenes de motas láser se comparó con el número de células inicial dentro de la macrocolonia (ver Fig. 4). El tiempo del valor máximo de la señal se define como el tiempo en que la actividad de la señal alcanza su máximo. El cultivo de E. coli durante la noche se diluyó en serie y se inoculó en el medio de agar LB como macrocolonias (el volumen de cada inóculo fue de 5 μL). El crecimiento de macrocolonias se registró utilizando un sistema de formación de imágenes de motas láser. Se determinó el tiempo del valor máximo de la señal para cada macrocolonia y se graficó frente al número de células inicial por macrocolonia. Se calcularon los valores medios del tiempo pico de la señal y la desviación estándar de las tres series de inoculación independientes (ver Fig. 4).

Dependencia del tiempo del valor máximo de la señal (líneas rojas en el gráfico de la izquierda y círculos azules en el gráfico de la derecha) obtenido por el sistema de imagen láser en el número inicial de células de E. coli en la colonia.

Los primeros resultados demostraron que el crecimiento de colonias dentro de un sistema de imágenes de motas era el mismo que en un escáner de superficie plana. Ligeras diferencias entre ellos surgen del crecimiento individual de la colonia, que puede verse afectado por la localización de la colonia dentro de la placa o la distancia a los vecinos más cercanos17. Mientras tanto, el tiempo del valor máximo de la señal de la señal moteada depende del número de células inicial dentro de la colonia. Si el número inicial de células en la colonia es grande, se requiere menos tiempo para alcanzar la máxima señal de moteado. Por otro lado, si el número inicial de celdas es pequeño, llevará más tiempo alcanzar el valor máximo de la señal de moteado. Aunque el crecimiento de la colonia continúa durante más de 20 h (consulte la Fig. 4 para E. coli), el máximo de la señal moteada se alcanza una vez y nunca se "recupera".

La señal obtenida por la correlación de subpíxeles de las imágenes de motas láser, que caracteriza la actividad bacteriana, aumentó dentro de la colonia, alcanzó su máximo y luego disminuyó. La intensidad de la señal tenía una distribución espaciotemporal notable. Diferentes partes de la colonia tenían diferentes tiempos máximos de señal. El pico máximo de actividad se observó inicialmente en el centro de la colonia. Con el tiempo, la "ola" de actividad migró desde el centro hacia los bordes de la colonia (véanse las Figs. 5 y 6). Este comportamiento espaciotemporal de la señal moteada se observó en todas las colonias microbianas analizadas: S. aureus, E. coli y V. natriegens. Aunque se realizaron análisis en profundidad sobre la estructura de la migración de la señal moteada en varias colonias de tres especies microbianas diferentes (V. natriegens, E. coli y S. aureus), la migración de la señal desde el centro hacia el borde de la colonia es característica de todas y cada una de las colonias microbianas. En la Fig. S1 complementaria, se muestra un ejemplo de parte de una placa de Petri con alrededor de 25 a 30 colonias. Cada una de las colonias después del análisis de correlación de subpíxeles muestra la formación del efecto de anillo de actividad descrito anteriormente.

Distribución espaciotemporal de la señal moteada en la colonia de S. aureus. Fila superior: dinámica de la señal a lo largo del tiempo en diferentes puntos dentro de la colonia (estrella blanca en los gráficos del medio). La línea verde marca la actividad máxima, después de lo cual la señal disminuye. Fila central: cambios en la actividad durante el crecimiento de la colonia. Fila inferior: imágenes moteadas sin procesar.

El momento de la actividad máxima de la colonia (el comienzo de la disminución de la actividad) durante el crecimiento de la colonia de S. aureus. Imagen superior: una imagen espaciotemporal bidimensional; imagen inferior: la actividad máxima en función del tiempo. También se observó un comportamiento espaciotemporal similar de la señal dentro de las colonias de E. coli y V. natriegens.

Es posible obtener una imagen que ilustre el comienzo de la disminución de la actividad en toda la colonia (ver Fig. 6, imagen superior) eligiendo los tiempos de inicio de la disminución en toda el área de la colonia y colocándolos en un mapa espacial bidimensional con las coordenadas correspondientes.

El "anillo" de alta actividad se forma alrededor del centro y luego migra junto con el frente de la colonia en crecimiento. El color muestra el tiempo (en horas) cuando la actividad comenzó a disminuir: el color azul (en el centro) representa lo más temprano, el color rojo representa lo último (borde de la colonia).

La ubicación de la primera disminución en el mapa se puede asumir como el punto de partida para el crecimiento de una colonia microbiana. Conociendo las coordenadas de este punto o centro de partida, es posible obtener una curva de crecimiento de la colonia en función del tiempo. Sin embargo, dado que el crecimiento de la colonia depende de varios factores (la disponibilidad de oxígeno y nutrientes, el movimiento browniano, el empuje y/o atracción de las células vecinas dentro de la colonia, la asincronía del crecimiento y la proliferación celular dentro de la colonia, etc.) la curva resultante tendrá una cierta dispersión de valores (Fig. 6, gráfico inferior). Por lo tanto, se aplicó un filtro de mediana móvil a los datos de curva suave15:

donde N es la longitud de la ventana, n es la muestra actual. La mediana es el número que se encuentra en medio de un conjunto de números ordenados en orden ascendente. Es decir, la mitad de los elementos del conjunto de números no son menores que la mediana y la otra mitad no es mayor que la mediana:

Este método se aplicó por las siguientes razones: (1) No intenta ajustar la curva a una forma específica: una línea recta, una parábola, etc. (2) A diferencia de un promedio móvil, no tiene en cuenta los valores atípicos. .

El efecto de "anillo" se obtuvo para los tres tipos de bacterias ensayadas. La tasa de crecimiento fue la principal diferencia que se observó (Fig. 7).

Curvas de actividad máxima de colonias en función del tiempo para 3–4 colonias de V. natriegens (azul), E. coli (rojo) y S. aureus (verde).

Tomando los puntos correspondientes a la distancia al centro de la colonia según la curva descrita en las Figs. 6 y 7, se obtienen las coordenadas en el espacio (x, y) para cada “anillo”. Una función de envolvente suavizada de la señal se coloca en cada uno de esos puntos en el espacio (Fig. 5). Así, muchas señales corresponderán a cada radio específico (la distancia desde el centro de la colonia hasta el punto de máxima actividad). En una situación ideal, todas las señales dentro del mismo "anillo" (a la misma distancia del centro de la colonia) serían las mismas. Sin embargo, el crecimiento de una colonia bacteriana se ve afectado por varias condiciones mencionadas anteriormente, por lo que estas señales son ligeramente diferentes. Por lo tanto, es necesario hacer un promedio de todas las señales para un radio dado, de manera que cada radio reciba una señal que lo caracterice. Dicho promedio se realizó adoptando el método de promedio truncado16, donde el truncamiento no se realizó en amplitud, sino en el tiempo del pico de actividad:

donde L es el número de señales de envolvente a una distancia dada, \({k}_{b}\) y \({k}_{f}\)—el número de señales de envolvente que fueron truncadas de cada lado. Es decir, no se consideraron aquellas señales cuyo pico de actividad en el radio dado difería mucho de la tendencia general (prematuras o retrasadas). Las señales promediadas obtenidas se mapearon en función de la distancia desde el centro y el tiempo (Fig. 8, imagen superior).

Envolventes de las señales promediadas en función de la distancia desde el centro de la colonia y el tiempo (arriba) y el pico de actividad en función de la distancia desde el centro de la colonia para diferentes tiempos (abajo) de S. aureus. También se observó un comportamiento espaciotemporal similar de la señal dentro de las colonias de E. coli y V. natriegens.

Al seleccionar varios puntos en el tiempo en el mapa, es posible observar cómo se verá el pico de actividad en función de la distancia desde el centro de la colonia. El ancho del pico es proporcional al ancho del "anillo" de actividad, y su cambio en el tiempo se muestra en el gráfico inferior de la Fig. 8.

El ancho espacial de la señal en diferentes momentos se puede observar en la Fig. 8. El ancho de la señal corresponde a la disminución desde el valor pico hasta un cierto valor. Si no hubiera ruido, ni señales no deseadas, ni ningún otro factor, el criterio sería simple: reducir el nivel de la señal o su potencia desde el valor máximo hasta cero. Sin embargo, en condiciones reales, debería haber algún umbral en el que la señal aún se pueda distinguir del ruido. Se eligió como criterio la disminución de la potencia de la señal del máximo a 1/3 del valor máximo. Es decir, debe tenerse en cuenta que el ancho real es ligeramente mayor que el recibido. Es posible encontrar el ancho para cada momento. Este ancho coincidirá con el ancho del "anillo" en el momento correspondiente (ver Fig. 9).

Determinación del ancho del "anillo" de actividad para la colonia de S. aureus: (a) valores de señal y ancho determinado del anillo de actividad (línea morada), (b) ancho obtenido del "anillo" de actividad, (c ) comparación del ancho obtenido del "anillo" de actividad (líneas negras) para una colonia en diferentes momentos. También se observó un comportamiento espaciotemporal similar de la señal dentro de las colonias de E. coli y V. natriegens.

De la Fig. 9a,b se puede observar que aunque el cambio en el ancho del anillo es pequeño, se puede considerar constante con algunas desviaciones. Es decir, desde el momento en que fue posible comenzar a observar el "anillo" y hasta el final de la observación, cuando desapareció el "anillo", el ancho del "anillo" permaneció aproximadamente sin cambios (con reservas sobre la precisión de la medición , fenómenos aleatorios en el comportamiento de una colonia de muchos microorganismos, ruido, etc.). El comportamiento descrito para una colonia seleccionada se observó para todos los tipos de bacterias considerados en este estudio. El ancho del "anillo" es diferente para cada tipo de bacteria. La Figura 10 muestra el ancho del "anillo" para todos los tipos de colonias bacterianas. Los resultados obtenidos corresponden al modelo matemático del crecimiento de colonias microbianas introducido por John Pirt ("Pirt model")5.

El ancho del "anillo" de actividad en función del tiempo para diferentes colonias bacterianas; (a) ancho del "anillo" de actividad determinado por el método del moteado; (b) ancho del "anillo" calculado usando el modelo Pirt (Ec. 9). Los parámetros: alfa y r para el modelo también se obtienen a partir de experimentos de motas. Cada curva demuestra el ancho del "anillo" de actividad a lo largo del tiempo de una colonia de un tipo de bacteria específico.

El estudio de Pirt5 proporciona una fórmula para calcular el ancho de la zona activa o el "anillo":

donde ω es el ancho de la zona de proliferación celular activa de la colonia, r es el radio de la colonia en el tiempo t, y \({r}_{0}\) es el radio en t = 0; α es la tasa de crecimiento específica también conocida como (μ, h−1), que se puede encontrar a partir de la ecuación de Gompertz8,17. Así, teniendo los datos experimentales (el radio de crecimiento de la colonia, el tiempo correspondiente y μ), es posible calcular el ancho de la zona activa o el ancho del "anillo" usando la Ec. (9). Los resultados obtenidos en este estudio y el modelo de Pirt se comparan en la Fig. 10.

El patrón general del ancho del anillo es único y uniforme para cada especie bacteriana. Sin embargo, la dinámica del ancho del anillo de actividad de cada colonia de una especie microbiana podría cambiar en el tiempo. Para colonias de mayor crecimiento, la proliferación y, por lo tanto, la actividad moteada de la colonia retiene su actividad durante más tiempo. Se puede suponer que esto está relacionado con la distribución de las colonias en la placa. Dado que las colonias bacterianas en las placas de agar se distribuyeron al azar, su crecimiento se vio afectado por las colonias microbianas vecinas. El crecimiento de las colonias microbianas se ve fuertemente afectado por las colonias vecinas en la proximidad, por lo que cuantas más colonias vecinas tenga una determinada colonia, antes cesará su crecimiento debido al agotamiento de los recursos nutricionales comunes del medio18,19.

El modelo de Pirt predice que el borde de crecimiento activo de la colonia microbiana podría tener un ancho similar al medido por la actividad moteada (compárese con la Fig. 10. V. natriegens a y b), mientras que sobreestima el ancho del borde activo de la colonia microbiana. colonia microbiana en el caso de E. coli y S. aureus. Puede implicarse que las diferencias se derivan del hecho de que la tasa de crecimiento α, h−1 en la ecuación de Pirt es una constante, mientras que de hecho cambia (disminuye) durante el crecimiento de la colonia4. Otro aspecto a considerar es que en ambos casos se utilizaron datos experimentales para los cálculos. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, el ruido ha influido en la precisión de la medición.

El crecimiento de colonias microbianas en medios de agar es una técnica utilizada en microbiología en investigación y pruebas de rutina para analizar la contaminación microbiana de muestras ambientales, alimentarias o médicas. Se utilizan muchos modelos matemáticos para describir el crecimiento de colonias microbianas4,5,18,20. El ancho de la zona de actividad exterior, "el anillo" de la colonia, a menudo se incluye en los modelos matemáticos para simplificar (linealizar) el cálculo de la dinámica de crecimiento de la colonia5,21. Sin embargo, los datos experimentales sobre el tamaño real de la zona de actividad de la colonia en crecimiento son escasos.

El modelo Pirt de crecimiento de colonias microbianas se encuentra entre los primeros que describen el crecimiento radial de colonias microbianas a lo largo del tiempo. El modelo se alinea bien con las observaciones reales si las colonias vecinas no inhiben el crecimiento y el tamaño de la zona de actividad en el borde es constante. El modelo de Pirt ha sido validado en macrocolonias de crecimiento distante que surgen de muchas células5. Sin embargo, en las pruebas de rutina de muestras ambientales o médicas, normalmente se observan microcolonias que crecen a una distancia aleatoria de las colonias vecinas22. Además, debido a la composición genómica o fisiológica de las especies microbianas, sus colonias crecen en diferentes formas tridimensionales (en forma de cúpula, planas, etc.), lo que a su vez podría influir en el ancho de la zona de actividad en el borde de la colonia23 .

En uno de los modelos recientes sugeridos por Warren et al.24, la orientación de las células microbianas (horizontal o vertical) junto con el agotamiento gradual de nutrientes alrededor de la colonia definen la dinámica del crecimiento de la colonia. Warren y sus colegas en sus simulaciones notaron la formación de una estructura de "anillo" metabólicamente activa alrededor de la colonia, que está formada por células que tienen contacto directo con el sustrato, y donde tiene lugar la mayor parte de la actividad de proliferación24.

En este (nuestro) estudio, se desarrolló un sistema basado en motas láser para registrar el crecimiento de colonias microbianas junto con un algoritmo de análisis de correlación de subpíxeles de imágenes de motas láser, que permite discriminar y cuantificar zonas de actividad dentro de la colonia. La señal de motas está en buena correlación con la tasa de crecimiento de la colonia y depende del número de células por colonia (véanse las Figs. 3 y 4).

Se observa cierta dispersión de los parámetros registrados por la formación de imágenes de motas (ancho del anillo de actividad, distancia máxima de migración desde el centro, curvas de crecimiento de colonias microbianas), lo que podría atribuirse a los cambios de propiedades del medio de agar, la variabilidad biológica de la muestra y/o o exactitud de las medidas.

Se sabe que las placas de agar tienden a perder agua (se secan) durante el cultivo microbiano25. La formación y la fuerza de la señal moteada pueden verse afectadas por el secado del medio de agar. De acuerdo con nuestras observaciones, en muchos experimentos en las primeras 3 a 5 h, pueden ocurrir efectos asociados con el secado del medio de agar. Sin embargo: (1) Este efecto se extendió por toda la placa de Petri como una "ola" y luego desapareció sin causar efectos adicionales. (2) El efecto observado de "secado" ocurrió mucho antes que la formación de "anillos". En consecuencia, incluso si apareció el secado, este efecto no afectó a la formación de anillos. Un ejemplo del efecto de secado se muestra en la Fig. 11. Además, Sandle et al. observaron una mayor pérdida de peso al comienzo (0-4 h) del cultivo que al final.

Imágenes moteadas del agar secado (medio de agar sin bacterias) en una placa de Petri.

El crecimiento de las colonias en el medio de agar fue similar después de la inoculación: las colonias tienden a tener la misma tasa de crecimiento inicial (ver Fig. 3) y su crecimiento divergió entre sí más tarde: las colonias dejaron de crecer en diferentes tiempos. Dado que la asignación de las colonias en la placa fue aleatoria, con un número variable de colonias vecinas, el agotamiento de los recursos y, posteriormente, el cese del crecimiento de cada colonia podría ocurrir en diferentes momentos. Sin embargo, cada colonia exhibió un anillo de actividad con una migración característica que se alejaba del centro y cese con el tiempo cuando disminuye el crecimiento activo (ver Fig. 12).

La señal del anillo de actividad cesa con el tiempo en las colonias envejecidas de Vibrio natriegens. Arriba: imágenes moteadas de colonias, Abajo: imagen después de aplicar el algoritmo de correlación de subpíxeles, anillo de cese de actividad.

Cuando una colonia ha dejado de estar activa, todavía es visible en las imágenes de motas sin procesar (Fig. 12 (arriba)) pero deja de mostrar un efecto de anillo (Fig. 12 (abajo)). Así, se concluye que los "anillos" no son fenómenos aleatorios relacionados con la desecación del agar, ni artefactos del borde de la colonia, sino una señal de actividad microbiana, que desaparecería cuando la colonia deje de crecer.

La técnica de speckle propuesta permite identificar y registrar la dinámica del ancho de la zona de actividad a lo largo del crecimiento de la micro y macro colonia. En el futuro, el registro del crecimiento de colonias mediante el uso de motas láser podría convertirse en una herramienta atractiva y no invasiva para cuantificar la dinámica de crecimiento y la actividad de proliferación con resolución de subcolonias.

El método de formación de imágenes de motas proporciona más información sobre la actividad microbiana dentro de las colonias que las series de imágenes estándar bajo luz blanca.

Se ha demostrado que la técnica de formación de imágenes de moteado láser es un método verdaderamente no invasivo, que permite controlar el crecimiento ininterrumpido de colonias microbianas (la tasa de crecimiento de las colonias bajo el sistema de moteado fue estadísticamente indistinguible del crecimiento microbiano en condiciones de referencia). Después de aplicar el algoritmo de correlación de subpíxeles ("Algoritmo de la conversión de imágenes moteadas en señales de tiempo"), el tiempo máximo de aparición de la señal moteada fue proporcional al número de células en la colonia (Fig. 4).

El análisis de subpíxeles de correlación sensible reveló que existen distintas zonas de actividad dentro de la colonia que migran desde el centro hacia los bordes durante el crecimiento de la colonia. Observamos un patrón similar de migración de la zona de actividad ("anillo") en las colonias de tres especies microbianas diferentes. Además, observamos la presencia del anillo en cada colonia en crecimiento activo (ver Fig. S1 complementaria). La velocidad de migración del "anillo" varió entre diferentes especies microbianas y, por lo tanto, reflejó sus diferentes tasas de crecimiento típicas para cada una de estas especies.

La imagenología moteada es una tecnología potente y prometedora que, por primera vez, ha ayudado a visualizar zonas de actividad dentro de la colonia microbiana. Anteriormente se predecía matemáticamente la presencia de estas zonas. El estudio actual también sugiere las posibles formas de desarrollar aún más la tecnología de imágenes de motas para estudios de colonias microbianas: aumentar la sensibilidad de los sistemas ópticos y electrónicos para la detección de motas, minimizar el ruido, buscar opciones para multiplexar la tecnología. Permitiría registrar la actividad de proliferación microbiana lo antes posible, así como detectar colonias de crecimiento lento e identificar la actividad microbiana dentro de la colonia, lo que hace que la técnica propuesta sea adecuada para muchas aplicaciones directas en investigación y desarrollo, medicina y epidemiología.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Esta investigación está financiada por el proyecto FEDER "Sistema basado en aprendizaje automático rápido y rentable para el análisis del crecimiento de microorganismos" (acuerdo No.1.1.1.1/19/A/147).

Facultad de Informática y Tecnología de la Información, Departamento de Control Informático y Redes Informáticas, Universidad Técnica de Riga, Zunda Krastmala 10, LV-1048, Riga, Letonia

Ilya Balmages y Dmitrijs Bliznuks

Laboratorija Auctoritas Ltd, Čiekurkalna 1. linija 11, Riga, LV-1026, Letonia

Ilya Balmages, Ernests Tomas Auzins y Edgars Baranovics

Instituto de Microbiología y Biotecnología, Universidad de Letonia, Jelgavas str. 1, Riga, LV-1004, Letonia

Janis Liepins y Ernests Tomas Auzins

Instituto de Física Atómica y Espectroscopia, Universidad de Letonia, Jelgavas str. 3, Riga, LV-1004, Letonia

Ilze Lihacova y Alexey Lihachev

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Conceptualización, IB, JL, DB, IL y AL; curación de datos, ETA, DB y EB; análisis formal, IB, JL, DB, IL y AL; adquisición de fondos, AL, DB y EB; investigación, IB, JL, DB, EB, IL y AL; metodología, IB, JL, DB y AL; administración de proyectos, AL y DB; recursos, IB, JL, DB, EB y AL; software, IB y DB; supervisión, visualización IB, IB; redacción: borrador original, IB y JL; redacción: revisión y edición, IB, JL, IL y AL

Correspondencia a Ilya Balmages.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Balmages, I., Liepins, J., Auzins, ET et al. Uso del análisis de correlación de subpíxeles de imágenes moteadas para revelar un mecanismo de crecimiento de colonias microbianas. Informe científico 13, 2613 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29809-0

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Recibido: 29 Agosto 2022

Aceptado: 10 febrero 2023

Publicado: 14 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29809-0

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