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Dec 02, 2023

Endomicroscopio láser confocal con escáner MEMS distal de verdad

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 20155 (2022) Citar este artículo

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Detalles de métricas

La endomicroscopia láser confocal es una metodología emergente para realizar biopsias ópticas en tiempo real. Las imágenes de fluorescencia con calidad similar a la histología se pueden recopilar instantáneamente del epitelio de los órganos huecos. Actualmente, la exploración se realiza en el extremo proximal de los instrumentos basados ​​en sondas que se utilizan habitualmente en la clínica, y la flexibilidad para controlar el enfoque es limitada. Demostramos el uso de un escáner de resonancia paramétrica empaquetado en el extremo distal del endomicroscopio para realizar desviaciones laterales de alta velocidad. Se grabó una abertura en el centro del reflector para plegar el camino óptico. Este diseño redujo las dimensiones del instrumento a 2,4 mm de diámetro y 10 mm de longitud, lo que permitió el paso hacia adelante a través del canal de trabajo de un endoscopio médico estándar. Un conjunto de lentes compacto proporciona una resolución lateral y axial de 1,1 y 13,6 μm, respectivamente. Se logró una distancia de trabajo de 0 μm y un campo de visión de 250 μm × 250 μm a velocidades de cuadro de hasta 20 Hz. Se administró excitación a 488 nm para excitar la fluoresceína, un tinte aprobado por la FDA, para generar un alto contraste tisular. El endomicroscopio se reprocesó utilizando un método de esterilización clínicamente aprobado durante 18 ciclos sin fallar. Se recogieron imágenes de fluorescencia durante la colonoscopia de rutina de mucosa colónica normal, adenomas tubulares, pólipos hiperplásicos, colitis ulcerosa y colitis de Crohn. Se pudieron identificar células individuales, incluidos colonocitos, células caliciformes y células inflamatorias. Se podían distinguir las características de la mucosa, como las estructuras de las criptas, los lúmenes de las criptas y la lámina propia. Este instrumento tiene potencial para ser utilizado como accesorio durante la endoscopia médica de rutina.

La endomicroscopia láser confocal es una modalidad de imagen emergente que se está desarrollando para uso clínico como un accesorio para la endoscopia médica de rutina1,2,3. Estos instrumentos flexibles acoplados a fibra se pueden utilizar para identificar enfermedades en el epitelio que recubre los órganos huecos, como el colon. Esta fina capa de tejido es metabólicamente muy activa y es el origen de muchos procesos patológicos, como el cáncer, las infecciones y la inflamación. La endomicroscopia puede lograr una resolución subcelular para proporcionar imágenes in vivo con calidad "similar a la histología" en tiempo real para guiar a los médicos en la toma de decisiones clínicas. La biopsia física de tejido conlleva un riesgo de sangrado y perforación. A menudo, se recolectan demasiadas o muy pocas biopsias. Cada espécimen resecado aumenta el costo del procedimiento. Se requieren varios días para procesar la muestra para que la evalúe un patólogo. Los pacientes a menudo experimentan ansiedad mientras esperan varios días para que los resultados de la patología estén disponibles. En comparación, otros métodos de imágenes clínicas, como MRI, CT, PET, SPECT y ultrasonido, carecen de la resolución espacial y las velocidades temporales necesarias para visualizar procesos epiteliales con resolución subcelular in vivo en tiempo real.

Un instrumento basado en una sonda (Cellvizio) se usa actualmente de forma rutinaria en la clínica para realizar una "biopsia óptica". El diseño se basa en un haz de fibras espacialmente coherente que recopila y transmite imágenes de fluorescencia4. Los núcleos de las fibras individuales sirven como "agujeros" para filtrar espacialmente la luz fuera de foco para lograr una resolución subcelular. El escaneo se realiza en el extremo proximal usando galvos grandes y voluminosos. Esta ubicación limita la capacidad del instrumento para controlar el enfoque. La estadificación adecuada de los cánceres epiteliales tempranos requiere visualización debajo de la superficie del tejido para evaluar la invasión y determinar la terapia adecuada. La fluoresceína, un agente de contraste aprobado por la FDA, se inyecta por vía intravenosa para resaltar las características estructurales del epitelio. Estos endomicroscopios tienen dimensiones <2,4 mm de diámetro y se pueden pasar fácilmente a través del canal de biopsia de los endoscopios médicos estándar. Esta flexibilidad permite un amplio uso clínico y es independiente del fabricante del endoscopio. Se han realizado numerosos estudios clínicos utilizando este instrumento de diagnóstico por imágenes, incluso en el esófago, el estómago, el colon y la cavidad oral, para la detección temprana del cáncer. Se han establecido protocolos de imágenes y se ha determinado la seguridad de este procedimiento.

Los sistemas microelectromecánicos (MEMS) son una tecnología poderosa para diseñar y fabricar mecanismos de escaneo en miniatura para usar en el extremo distal de los endomicroscopios. Esta ubicación (frente a la proximal) ofrece una flexibilidad mucho mayor para controlar la posición del foco5,6. Además de las desviaciones laterales, los mecanismos distales pueden realizar exploraciones de acceso aleatorio, posobjetivo y axial. Estas funciones permiten una interrogación más completa del epitelio, incluidas imágenes transversales verticales7, exploración sin aberraciones en un gran campo de visión (FOV)8 y rendimiento mejorado en subregiones definidas por el usuario9, respectivamente. MEMS aborda los considerables desafíos que plantea el espacio limitado disponible en la punta distal del instrumento para empaquetar el mecanismo de exploración. En comparación con los galvos voluminosos, MEMS proporciona un rendimiento superior en un factor de forma pequeño con alta velocidad y bajo consumo. Los procesos de fabricación simples se pueden escalar para la fabricación en masa a bajo costo. Anteriormente se han informado varios diseños de MEMS10,11,12. Ninguno se ha desarrollado lo suficiente como para realizar imágenes in vivo en tiempo real a través del canal de trabajo de un endoscopio médico para permitir una traducción clínica amplia. Aquí, nuestro objetivo es demostrar el uso de un escáner MEMS en la punta distal de un endomicroscopio para recopilar imágenes in vivo en sujetos humanos durante la endoscopia clínica de rutina.

Se desarrolló un instrumento de fibra acoplada utilizando un escáner MEMS en la punta distal para recopilar imágenes de fluorescencia en tiempo real in vivo con características similares a las de la histología. Una fibra monomodo (SMF) se encerró en un tubo de polímero flexible y proporcionó excitación a λex = 488 nm. Esta configuración acorta la longitud de la punta distal y permite el paso hacia adelante a través del canal de trabajo de los endoscopios médicos estándar. Se usó una férula para centrar los componentes ópticos. Las lentes se diseñaron para lograr una resolución limitada por difracción cercana en el eje con una apertura numérica (NA) = 0,41 y una distancia de trabajo = 0 μm13. Se fabricaron espaciadores de precisión para alinear con precisión la óptica14. El escáner se empaquetó en un endomicroscopio con una punta distal rígida de 2,4 mm de diámetro y 10 mm de longitud (Fig. 1a). Estas dimensiones permiten su uso clínico como accesorio durante la endoscopia (Fig. 1b). La potencia máxima del láser incidente sobre el tejido fue de 2 mW.

Endomicroscopio láser confocal (CLE) y escáner MEMS. Se muestra una fotografía de (a) el instrumento empaquetado con unas dimensiones de punta distal rígida de 2,4 mm de diámetro y 10 mm de longitud, y (b) paso hacia adelante a través del canal de trabajo de un endoscopio médico estándar (Olympus CF-HQ190L). (c) La vista frontal del escáner muestra un reflector con una abertura central de 50 μm de diámetro para permitir el paso del haz de excitación. El escáner está montado en un cardán impulsado por un conjunto de actuadores ortogonales de peine. Las frecuencias de resonancia de este dispositivo están determinadas por las dimensiones de los resortes de torsión. (d) La vista lateral del escáner muestra el escáner montado en el soporte con cables para anclajes de electrodos que proporcionan puntos de conexión para las señales de accionamiento y la alimentación.

El mecanismo de escaneo consistía en un reflector montado en un cardán impulsado por un conjunto de actuadores de accionamiento de peine ortogonales para desviar el haz lateralmente (plano XY) en un patrón de Lissajous (Fig. 1c). Se grabó una abertura de 50 μm de diámetro en el centro para pasar el haz de excitación. El escáner se condujo cerca de las frecuencias de resonancia de la estructura, que podrían sintonizarse modificando las dimensiones de los resortes de torsión. Se grabaron anclajes de electrodos alrededor de la periferia del dispositivo para proporcionar puntos de conexión para la alimentación y la señal de accionamiento (Fig. 1d).

El sistema de imágenes se colocó en un carro portátil que se podía llevar a la sala de procedimientos. Se desarrolló una interfaz gráfica de usuario para ayudar a los usuarios con conocimientos técnicos mínimos, como médicos y enfermeras. La frecuencia de activación del escáner, el patrón de forma del haz y el FOV de la imagen se comprobaron manualmente.

La longitud total del endomicroscopio era de ~4 m para permitir que el instrumento pasara completamente a través del canal de trabajo (1,68 m) de un endoscopio médico estándar con una longitud extra para facilitar la maniobrabilidad. En el extremo proximal del endomicroscopio, el SMF y los cables terminaban en conectores que se insertaban en los puertos de fibra y cable de la estación base. Esta unidad contenía el láser, el bloque de filtro óptico, los amplificadores de alto voltaje y el detector de tubo fotomultiplicador (PMT). Los amplificadores entregaron potencia y señales de conducción al escáner. El bloque de filtro óptico acopló la excitación del láser en el SMF y entregó fluorescencia al PMT.

El endomicroscopio se reprocesó después de cada procedimiento clínico utilizando el proceso de esterilización STERRAD y sobrevivió hasta 18 ciclos sin fallar. Para la solución de OPA, no se encontraron signos de daño después de más de 10 ciclos de desinfección. Los resultados de OPA fueron mejores que los de STERRAD, y sugiere que la vida útil de los endomicroscopios se puede extender con desinfección de alto nivel en lugar de esterilización para reprocesamiento.

La resolución de la imagen se determinó mediante la función de dispersión de puntos utilizando perlas fluorescentes de 0,1 μm de diámetro. Se midió un ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) de 1.1 y 13.6 μm para la resolución lateral y axial, respectivamente (Fig. 2a, b).

Parámetros de la imagen. ( a ) La resolución lateral y (b) axial de la óptica de enfoque se caracterizó por una función de dispersión de puntos (PSF) medida utilizando microesferas fluorescentes de 0, 1 μm de diámetro. Se midió un ancho medio máximo (FWHM) de 1,1 y 13,6 μm, respectivamente. Recuadro: se muestra una vista ampliada de microesferas individuales en las direcciones lateral (XY) y axial (XZ). (c) Una imagen de fluorescencia recopilada de barras diana estándar (USAF 1951) (óvalo rojo) muestra que el grupo 7-6 se puede resolver claramente. (d) Una imagen de microesferas fluorescentes dispersas de 10 μm de diámetro demuestra un FOV de imagen de 250 μm × 250 μm. Los PSF en (a, b) se trazaron utilizando MATLAB R2019a (https://www.mathworks.com/). (c, d) Las imágenes de fluorescencia se recopilaron utilizando LabVIEW 2021 (https://www.ni.com/).

Una imagen de fluorescencia de un objetivo de resolución estándar distinguió claramente el conjunto de barras en el grupo 7-6 para admitir una alta resolución lateral (Fig. 2c). Se determinó un campo de visión (FOV) de 250 μm × 250 μm a partir de una imagen de perlas fluorescentes de 10 μm de diámetro dispersas sobre un cubreobjetos de vidrio (Fig. 2d).

Se implementaron métodos automatizados para el control de ganancia de PMT y la corrección de fase en el sistema de imágenes clínicas para mitigar el artefacto de movimiento del endoscopio, el peristaltismo del colon y la respiración del paciente. Los algoritmos de reconstrucción y procesamiento de imágenes se han descrito previamente14,15. La ganancia de PMT se ajustó utilizando un controlador proporcional-integral (PI) para evitar la saturación de intensidad16. El sistema lee una intensidad de píxel máxima por cuadro, calcula la respuesta proporcional e integral y determina un valor para la ganancia de PMT para proporcionar intensidades de píxel dentro de un rango aceptable.

Durante la obtención de imágenes in vivo, una falta de coincidencia en la fase entre el movimiento del escáner y la señal de conducción puede generar imágenes borrosas. Este efecto puede ocurrir por variaciones de temperatura con el instrumento dentro del cuerpo humano. Una imagen de luz blanca muestra el endomicroscopio colocado en contacto con la mucosa colónica normal in vivo (Fig. 3a). En la imagen sin procesar de la mucosa colónica normal se puede ver la borrosidad de los píxeles mal registrados (Fig. 3b). Después del procesamiento utilizando la fase y el ajuste de contraste correctos, se pudieron distinguir las características subcelulares en la mucosa (Fig. 3c). En Información complementaria, las imágenes confocal sin procesar y procesadas en tiempo real se proporcionan en la Fig. S1, y los parámetros de reconstrucción de imágenes utilizados para el procesamiento posterior y en tiempo real se proporcionan en las Tablas S1 y S2.

Procesamiento de imágenes. (a) La imagen endoscópica de campo amplio muestra el endomicroscopio (E) colocado en contacto con la mucosa colónica normal (N) para la recolección de imágenes de fluorescencia in vivo después de la administración de fluoresceína. (b) La desviación en la fase de los ejes X e Y durante el escaneo puede resultar en desenfoque debido a píxeles mal registrados. Se aplicaron grandes cambios de fase a la imagen original para demostración. (c) Después de la corrección de fase posprocesada, se pueden apreciar detalles de la mucosa, incluida la estructura de la cripta (flecha) con la luz central (l) rodeada por una lámina propia (lp). Se pueden distinguir células individuales, incluidos colonocitos (c), células caliciformes (g) y células inflamatorias (punta de flecha). Consulte el Video complementario 1. (b, c) Las imágenes se procesaron con LabVIEW 2021.

Se recolectaron imágenes de fluorescencia confocal in vivo de varias enfermedades en el colon para demostrar la amplia aplicabilidad clínica de este instrumento. Primero se realizaron imágenes de campo amplio utilizando iluminación de luz blanca para identificar la mucosa de aspecto anormal. A continuación, se pasó el endomicroscopio a través del canal de trabajo del colonoscopio y se puso en contacto con la mucosa.

Se muestran imágenes de endoscopia de campo amplio, endomicroscopia confocal e histología (H&E) para la neoplasia colónica, incluidos el adenoma tubular y el pólipo hiperplásico. El adenoma tubular muestra una pérdida de la arquitectura normal de la cripta, disminución del tamaño de las células caliciformes, luces de la cripta distorsionadas y lámina propia abarrotada (fig. 4a-c). El pólipo hiperplásico muestra una estructura de cripta estrellada, pocas células caliciformes, lúmenes de cripta en forma de hendidura y lámina propia irregular (Fig. 4d-f).

Imágenes in vivo de la mucosa colónica. Se muestran imágenes representativas de endoscopia de luz blanca, endomicroscopio confocal e histología (H&E) para (ac) adenoma, (df) pólipo hiperplásico, (gi) colitis ulcerosa y (jl) colitis de Crohn. (b) Se muestra imagen confocal recogida con el endomicroscopio (E) in vivo de un adenoma tubular (TA). Esta lesión premaligna muestra una pérdida de la arquitectura normal de la cripta (flecha), luces de la cripta distorsionadas (l) y lámina propia abarrotada (lp). También se pueden identificar colonocitos (c), células caliciformes (g) y células inflamatorias (punta de flecha). Consulte el video complementario 2. ( e ) Se muestra una imagen confocal recopilada in vivo de un pólipo hiperplásico (HP). Esta lesión benigna muestra una estructura de cripta estrellada (flecha), lúmenes de cripta en forma de hendidura (l) y lámina propia irregular (lp). También se pueden identificar colonocitos (c), pocas células caliciformes (g) y células inflamatorias (punta de flecha). Consulte el video complementario 3. (h) Se muestra la imagen confocal recolectada in vivo de la colitis ulcerosa (UC). Esta afección inflamatoria muestra una arquitectura de cripta distorsionada (flechas) con células caliciformes prominentes (g). Los penachos de fluoresceína (f) se extruyen del epitelio, lo que refleja una mayor permeabilidad vascular. Se pueden ver muchas células inflamatorias (puntas de flecha) en la lámina propia (lp). Consulte el video complementario 4. (k) Se muestra una imagen confocal recopilada in vivo de áreas irregulares de la colitis de Crohn (CC). Esta afección inflamatoria muestra una arquitectura de cripta distorsionada (flechas) con células caliciformes prominentes (g). Los penachos de fluoresceína (f) se extruyen del epitelio, lo que refleja una mayor permeabilidad vascular. Se pueden ver muchas células inflamatorias (puntas de flecha) en la lámina propia (lp). Consulte el Video complementario 5. (b, e, h, k) Las imágenes se procesaron con LabVIEW 2021.

Se muestra un conjunto similar de imágenes para la inflamación del colon, incluida la colitis ulcerosa (UC) (Fig. 4g–i) y la colitis de Crohn (Fig. 4j–l). Se puede apreciar una reacción inflamatoria caracterizada por una arquitectura distorsionada de la cripta con células caliciformes prominentes. La fluoresceína sale del epitelio, un reflejo del aumento de la permeabilidad vascular. Se pueden observar numerosas células inflamatorias en la lámina propia.

Hemos demostrado el uso clínico de un endomicroscopio láser confocal acoplado a fibra flexible utilizando un escáner MEMS ubicado en el extremo distal para recopilar imágenes in vivo. En frecuencias resonantes, se lograron frecuencias de cuadro de hasta 20 Hz con un patrón de escaneo Lissajous de alta densidad para mitigar el artefacto de movimiento. La trayectoria óptica se plegó para permitir que el haz se expandiera y generara una AN suficiente para lograr una resolución lateral de 1,1 μm. Se recogieron imágenes de fluorescencia con calidad similar a la histología durante la colonoscopia de rutina de mucosa colónica normal, adenomas tubulares, pólipos hiperplásicos, colitis ulcerosa y colitis de Crohn. Se pudieron identificar células individuales, incluidos colonocitos, células caliciformes y células inflamatorias. Se podían distinguir las características de la mucosa, como las estructuras de las criptas, los lúmenes de las criptas y la lámina propia. Se microfabricaron aparatos de precisión para proporcionar una alineación precisa de los componentes ópticos y mecánicos individuales dentro de un instrumento de 2,4 mm de diámetro y 10 mm de longitud. El diseño óptico redujo adecuadamente la longitud de la punta distal rígida para permitir el paso hacia adelante a través de un canal de trabajo con dimensiones estándar (3,2 mm de diámetro) en endoscopios médicos. Por lo tanto, este instrumento puede ser ampliamente utilizado por médicos comunitarios independientemente del fabricante. Se administró excitación a λex = 488 nm para excitar la fluoresceína, un tinte aprobado por la FDA, para generar un alto contraste. El instrumento se reprocesó utilizando métodos de esterilización clínicamente aprobados durante 18 ciclos sin fallar.

Se han demostrado otros dos diseños de instrumentos en la clínica. El Cellvizio (Mauna Kea Technologies) es un endomicroscopio láser confocal basado en sonda (pCLE) que utiliza un haz de fibra óptica coherente multimodo para recopilar y transmitir imágenes de fluorescencia1. Un galvo ubicado en la estación base realiza un escaneo lateral en el extremo proximal. Las secciones ópticas se recogen en el plano horizontal (XY) a profundidades de 0 a 70 μm. Hay disponible un juego de minisondas con diámetros desde 0,91 (aguja de 19 G) hasta 5 mm. Se ha conseguido una resolución lateral de entre 1 y 3,5 μm. Las imágenes se recopilan a velocidades de cuadro entre 9 y 12 Hz con un FOV entre 240 y 600 μm en una dimensión. Esta plataforma se ha utilizado clínicamente en varias aplicaciones, incluidas las vías biliares, la vejiga, el colon, el esófago, los pulmones y el páncreas. Optiscan Pty Ltd desarrolló un endomicroscopio láser confocal basado en endoscopio (eCLE) con el mecanismo de exploración integrado en el tubo de inserción (extremo distal) de un endoscopio especial (EC-3870K, Pentax Precision Instrument)17. Se utilizó una fibra monomodo para realizar el seccionamiento óptico y se realizó un escaneo lateral mediante un mecanismo en voladizo mediante un diapasón resonante. Se usó un actuador de aleación con memoria de forma (Nitinol) para generar el desplazamiento axial. El diámetro total del módulo confocal era de 5 mm. Para el enfoque se utilizó una lente GRIN con NA = 0,6. Se recogieron imágenes horizontales con una resolución lateral y axial de 0,7 y 7 μm, respectivamente, a velocidades de cuadro de 0,8-1,6 Hz con un FOV de 500 μm × 500 μm.

Demostramos el uso de un escáner MEMS ubicado en la punta distal para recopilar imágenes de fluorescencia in vivo con resolución subcelular de sujetos humanos a través de un endoscopio médico. La fluorescencia proporciona un alto contraste de imagen y los ligandos que se unen a los objetivos de la superficie celular se pueden marcar con fluoróforos para proporcionar propiedades moleculares para mejorar el diagnóstico de enfermedades18. Se están desarrollando otros métodos ópticos para la endomicroscopia in vivo. OCT utiliza la longitud de coherencia corta de una fuente de luz de banda ancha para recopilar imágenes en el plano vertical con profundidades > 1 mm19. Sin embargo, esta metodología de bajo contraste se basa en la recolección de luz retrodispersada y la resolución de la imagen está limitada por artefactos de motas. La endomicroscopia fotoacústica genera imágenes in vivo basadas en una rápida expansión termoelástica en el tejido tras la absorción de un pulso láser y genera una onda acústica20. Este enfoque ha demostrado profundidades de imagen > 1 cm en colon humano in vivo para monitorear la terapia. El contraste se genera principalmente a partir de la hemoglobina en la vasculatura. La endomicroscopia multifotónica genera imágenes de fluorescencia de alto contraste cuando dos o más fotones NIR llegan a una biomolécula tisular simultáneamente21. Este enfoque puede lograr profundidades de imagen > 1 mm con baja fototoxicidad. Se requieren pulsos de láser de femtosegundos de alta intensidad y esta modalidad no se ha demostrado clínicamente durante la endoscopia.

En este prototipo, el escáner solo realizaba desviación lateral, por lo que las secciones ópticas se mostraban en el plano horizontal (XY). Este dispositivo pudo alcanzar frecuencias de cuadro (20 Hz) más altas en comparación con los galvos del sistema Cellvizio (12 Hz). La velocidad de fotogramas se aumentó para mitigar el artefacto de movimiento y se redujo para aumentar la señal. Se requerirán altas velocidades y algoritmos automatizados para mitigar los grandes artefactos de movimiento del endoscopio, el movimiento respiratorio y el peristaltismo intestinal. Se ha demostrado que los escáneres de resonancia paramétrica logran desplazamientos axiales de varios cientos de micras22. Las imágenes se pueden recopilar en un plano vertical (XZ), perpendicular a la superficie de la mucosa, para proporcionar la misma vista que la histología (H&E). El escáner se puede colocar en la posición posterior al objetivo, donde el haz de iluminación incide a lo largo del eje óptico principal para reducir la sensibilidad a las aberraciones8. Un volumen focal limitado por difracción cercana se puede desviar sobre un FOV arbitrariamente grande. Se puede realizar un escaneo de acceso aleatorio para desviar el reflector en posiciones definidas por el usuario9. El FOV se puede reducir para resaltar subregiones de imágenes arbitrarias para mejorar la relación señal-ruido, el contraste y la velocidad de fotogramas. Los escáneres se pueden fabricar por lotes utilizando procesos simples. Se pueden producir cientos de dispositivos en cada oblea de silicio para aumentar la producción para la fabricación en masa y una amplia difusión a bajo costo.

El camino óptico plegado redujo las dimensiones de la punta distal rígida para permitir el uso continuo del endomicroscopio como accesorio durante la colonoscopia de rutina. En las imágenes de fluorescencia que se muestran, se pudieron visualizar las características de la mucosa subcelular para distinguir los adenomas tubulares (premalignos) de los pólipos hiperplásicos (benignos). Estos resultados demuestran el potencial de la endomicroscopia para reducir las biopsias innecesarias23. Las complicaciones generales relacionadas con el procedimiento pueden reducirse, los intervalos de vigilancia pueden optimizarse y el análisis histológico de lesiones insignificantes puede minimizarse. También demostramos imágenes in vivo de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal, incluida la colitis ulcerosa (CU) y la colitis de Crohn. La colonoscopia con luz blanca convencional proporciona una apariencia macroscópica de la superficie de la mucosa con una capacidad limitada para evaluar con precisión la cicatrización de la mucosa. La endomicroscopia se puede utilizar in vivo para evaluar la eficacia de las terapias biológicas, como los anticuerpos anti-TNF24. La evaluación precisa in vivo también puede reducir o prevenir la recaída de la enfermedad y las complicaciones, como la cirugía, y mejorar la calidad de vida. En el estudio clínico, no se informaron reacciones adversas graves relacionadas con el uso in vivo del endomicroscopio con la fluoresceína25. La potencia del láser en la superficie de la mucosa se limitó a <2 mW para minimizar el riesgo de lesiones térmicas y cumplir con los requisitos de la FDA para riesgos no significativos26 según 21 CFR 812.

El diseño de este instrumento se puede modificar para mejorar el rendimiento de las imágenes. Se pueden utilizar ópticas personalizadas para reducir las aberraciones esféricas, mejorar la resolución de la imagen y aumentar la distancia de trabajo. El SIL se puede adaptar para que coincida mejor con el índice de refracción del tejido (~ 1,4) para mejorar el acoplamiento de la luz. La frecuencia de la unidad se puede ajustar para aumentar el ángulo de desviación lateral del escáner para ampliar el campo de visión de la imagen. Se pueden implementar métodos automatizados para eliminar marcos de imágenes con movimiento significativo para mitigar este efecto. Se implementará una matriz de puertas programables en campo (FPGA) con adquisición de datos de alta velocidad para lograr una corrección de fotograma completo de alto rendimiento en tiempo real. Para una mayor utilidad clínica, los métodos automatizados deben corregir los cambios de fase y el artefacto de movimiento para interpretar las imágenes en tiempo real. Se puede implementar un escáner de resonancia paramétrica monolítica de 3 ejes para introducir el escaneo axial22. Estos dispositivos se han desarrollado para lograr un desplazamiento vertical >400 µm sin precedentes ajustando la frecuencia de excitación en un régimen que presenta una dinámica mixta de ablandamiento/endurecimiento27. En el futuro, las imágenes transversales verticales pueden ser útiles para la estadificación del cáncer temprano (T1a). Se puede implementar un circuito de detección capacitivo para rastrear el movimiento del escáner y corregir los cambios de fase28. La calibración de fase automatizada mediante un circuito de detección puede reemplazar la calibración manual antes del uso del instrumento. La confiabilidad del instrumento se puede mejorar con el uso de métodos más robustos para sellar el instrumento y aumentar el número de ciclos de reprocesamiento. La tecnología MEMS promete acelerar el uso de endomicroscopios para visualizar el epitelio de los órganos huecos para diagnosticar enfermedades y monitorear la terapia de una manera mínimamente invasiva. Con un mayor desarrollo, esta metodología de imagen emergente puede convertirse en una solución de bajo costo para su uso como un accesorio de la endoscopia médica para proporcionar una histología instantánea y eventualmente puede reemplazar el análisis patológico convencional.

Las simulaciones de trazado de rayos se realizaron con el software de diseño óptico ZEMAX (ver 2013) para definir los parámetros de la óptica de enfoque. Los criterios de diseño incluyeron resolución limitada por difracción cercana en el eje, distancia de trabajo = 0 μm y campo de visión (FOV) superior a 250 × 250 μm2. Se utilizó una fibra monomodo (SMF) para proporcionar excitación a λex = 488 nm. Se usaron dobletes acromáticos para mitigar la dispersión cromática para la recolección de fluorescencia (Fig. 5a). El haz se entregó a través de un SMF con un diámetro de campo modal de 3,5 μm y pasa por el centro del reflector con una apertura de 50 μm de diámetro sin truncamiento. Se utilizó una lente de inmersión sólida (media bola) con alto índice de refracción (n = 2,03) para minimizar las aberraciones esféricas del haz incidente y proporcionar un contacto completo con la superficie de la mucosa. La óptica de enfoque proporciona un NA total = 0,41, donde NA = nsinα, n es el índice de refracción del tejido y α es el ángulo máximo de convergencia del haz. El límite de difracción para la resolución lateral y axial es de 0,44 y 6,65 μm, respectivamente, utilizando valores de NA = 0,41, λ = 488 nm y n = 1,3313. Solo se consideraron lentes disponibles en el mercado con un diámetro exterior (DE) ≤ 2 mm. La trayectoria óptica se plegó por lo que el haz que salía del SMF pasaba a través de una abertura central en el escáner y se reflejaba hacia atrás en un espejo fijo (0,29 mm de diámetro). Esta configuración acorta la longitud de la punta distal rígida para facilitar el paso hacia adelante del endomicroscopio a través de un canal de trabajo estándar (3,2 mm de diámetro) en los endoscopios médicos. Esta capacidad permite un uso continuo como accesorio durante la endoscopia de rutina.

Empaque plegado de camino óptico y endomicroscopio. (a) El haz de excitación sale del SMF y pasa a través de la apertura central del escáner. El haz se expande y se refleja en un espejo circular fijo hacia el escáner en busca de desviaciones laterales. La óptica de enfoque consta de un par de dobletes acromáticos y una lente de inmersión sólida (media bola) que proporciona contacto con la superficie de la mucosa. Se utilizó ZEMAX 2013 (https://www.zemax.com/) para el diseño óptico y la simulación de trazado de rayos. (b) Se muestra la disposición del empaque para los componentes individuales del instrumento, incluida la fibra monomodo (SMF), el escáner, el espejo y las lentes. Se utilizó Solidworks 2016 (https://www.solidworks.com/) para el modelado 3D del embalaje del endomicroscopio.

Se usó un SMF con un diámetro de campo modal de 3,5 μm a 488 nm (# 460HP, Thorlabs) para que sirviera como un "agujero" para filtrar espacialmente la luz fuera de foco (Fig. 5b). El SMF estaba encerrado en un tubo de polímero flexible (#Pebax 72D, Nordson MEDICAL). Se utilizó una longitud de ~4 metros para proporcionar una distancia suficiente entre el paciente y el sistema de imágenes. Se usaron un par de dobletes acromáticos recubiertos con MgF2 de 2 mm de diámetro (#65568, #65567, Edmund Optics) y una lente de media bola de 2 mm de diámetro sin recubrimiento (#90858, Edmund Optics) para enfocar el haz y recolectar la fluorescencia. Se insertó un tubo final de acero inoxidable (4 mm de longitud, 2,0 mm de DE, 1,6 mm de DI) entre el polímero y los tubos exteriores para aislar el escáner de las vibraciones. Se aplicó un adhesivo de grado médico para sellar el instrumento de los fluidos corporales y durante el reprocesamiento. Se usó un tubo termorretráctil para proteger la interfaz.

Se fabricó un escáner compacto basado en el principio de resonancia paramétrica14. Se grabó una abertura de 50 μm en el centro del reflector para pasar el haz de excitación. El haz expandido se desvió lateralmente en direcciones ortogonales (plano XY) en un patrón de Lissajous utilizando un conjunto de actuadores de accionamiento de peine ortogonales. Se usó una placa de adquisición de datos (#DAQ PCI-6115, NI) para crear la forma de onda analógica para controlar el escáner. La energía fue proporcionada por amplificadores de alto voltaje (#PDm200, PiezoDrive) a través de finos cables eléctricos (#B4421241, MWS Wire Industries). El cableado se realizó sobre anclajes de electrodos. El escáner se condujo a frecuencias cercanas a 15 kHz (eje rápido) y 4 kHz (eje lento) para lograr un FOV de hasta 250 μm × 250 μm. Los videos se pueden recopilar a velocidades de cuadro de 10, 16 o 20 Hz. Estas frecuencias de cuadro se utilizaron para igualar la frecuencia de repetición del patrón de escaneo de Lissajous, que depende del valor de las frecuencias de control X e Y del escáner29. En nuestro trabajo anterior14 se proporcionan detalles sobre las compensaciones entre la velocidad de fotogramas, la resolución de píxeles y la densidad del patrón de escaneo.

Un láser de estado sólido (#OBIS 488 LS, Coherent) entregó λex = 488 nm para excitar la fluoresceína para el contraste de la imagen (Fig. 6a). El cable flexible de fibra se acopló a un bloque de filtro óptico a través de un conector FC/APC (pérdida de 1,82 dB) (Fig. 6b). El haz fue desviado por un espejo dicroico (#WDM-12P-111-488/500:600, Oz Optics) hacia el SMF a través de otro conector FC/APC. La energía incidente en el tejido se limitó a un máximo de 2 mW para cumplir con los requisitos de la FDA para riesgos no significativos según 21 CFR 812. La fluorescencia pasó a través del espejo dicroico y un filtro de paso largo (#BLP01-488R, Semrock). Se usó una fibra multimodo de ~1 m de largo con un diámetro de núcleo de 50 μm para transmitir fluorescencia a través de un conector FC/PC al detector de tubo fotomultiplicador (PMT) (#H7422-40, Hamamatsu). La señal de fluorescencia fue amplificada por un amplificador de corriente de alta velocidad (#59-179, Edmund Optics). Se desarrolló un software personalizado (LabVIEW 2021, NI) para realizar la adquisición de datos y el procesamiento de imágenes en tiempo real. Los ajustes de potencia del láser y ganancia de PMT fueron determinados por un microcontrolador (#Arduino UNO, Arduino) utilizando una placa de circuito impresa personalizada. El SMF y los cables se terminaron con conectores y se insertaron en los puertos de fibra (F) y cable (W) de la estación base (Fig. 6c). El sistema de imágenes estaba contenido en un carro portátil (Fig. 6d). Se utilizó un transformador de aislamiento para limitar la corriente de fuga a <500 μA.

Sistema de imagen. (a) El PMT, el láser y los amplificadores están contenidos dentro de la estación base. (b) En el bloque de filtro, el láser (azul) proporciona excitación a través de un cable flexible de fibra a través de un conector FC/APC. El haz es desviado por un espejo dicroico (DM) hacia una fibra monomodo (SMF) a través de un segundo conector FC/APC. La fluorescencia (verde) pasa a través del DM y un filtro de paso largo (LPF) al PMT a través de una fibra multimodo (MMF). (c) El extremo proximal del endomicroscopio se conecta a los puertos de fibra (F) y cable (W) de la estación base. (d) El endomicroscopio, el monitor, la estación base, la computadora y el transformador de aislamiento están contenidos en un carro portátil. (a, c) Se utilizó Solidworks 2016 para el modelado 3D del ensamblaje del sistema de imágenes y el endomicroscopio.

La resolución lateral y axial de la óptica de enfoque se midió a partir de la función de dispersión de puntos de microesferas fluorescentes de 0,1 μm de diámetro (#F8803, Thermo Fisher Scientific). Las imágenes se recogieron traduciendo las microesferas en dirección horizontal y vertical en incrementos de 1 μm utilizando una platina lineal (#M-562-XYZ, DM-13, Newport). Las imágenes se apilaron utilizando ImageJ2 para obtener imágenes transversales de las microesferas.

Se desarrolló un software personalizado (LabVIEW 2021, NI) para realizar la adquisición de datos y el procesamiento de imágenes en tiempo real. En la Fig. 7 se muestra una descripción general de las rutinas utilizadas para el funcionamiento del sistema. La interfaz de usuario consta de paneles de adquisición de datos (DAQ), principal y controlador. El panel DAQ se comunica con el panel principal para adquirir y guardar datos sin procesar, proporciona información para la configuración de adquisición de datos definida por el usuario y controla los parámetros de activación del escáner. El panel principal permite al usuario seleccionar la configuración deseada para usar el endomicroscopio, incluidas las señales de transmisión al escáner, la velocidad de cuadros de video y los parámetros de adquisición de datos. Este panel también permite a los usuarios visualizar y controlar el brillo y el contraste de la imagen. Usando datos sin procesar como entrada, un algoritmo calcula la configuración de ganancia óptima para el PMT y ajusta automáticamente este parámetro usando un sistema de control de retroalimentación basado en integral proporcional (PI)16. El panel del controlador se comunica con los paneles principal y DAQ para controlar la potencia del láser y la ganancia de PMT.

Arquitectura del software del sistema. La interfaz de usuario incluye módulos para (1) adquisición de datos (DAQ), (2) panel principal y (3) panel del controlador. Los programas se ejecutan simultáneamente y se comunican entre sí a través de colas de mensajes. Clave – MEMS: sistemas microelectromecánicos, TDMS: streaming de gestión de datos técnicos, PI: proporcional-integral, PMT: tubo fotomultiplicador. Los archivos de imagen y video se guardan en formato BMP y AVI, respectivamente.

Se usó un algoritmo de corrección de fase para calcular la variación en las intensidades de píxeles de la imagen en varios valores de fase para determinar el valor más grande para agudizar la imagen15. Para la corrección en tiempo real, la fase se barrió en un rango de ±2,86° con un tamaño de paso relativamente grande de 0,286° para reducir el tiempo de cálculo. Además, se utilizó una región parcial de la imagen con un número menor de muestras para reducir aún más el tiempo de cálculo de 7,5 s (1 M muestras) a 1,88 s (250 K muestras) por cuadro de imagen a 10 Hz. Estos parámetros de entrada se eligieron para proporcionar una calidad de imagen suficiente con un retraso mínimo durante la obtención de imágenes in vivo. Las imágenes y videos en tiempo real se graban en formatos BMP y AVI, respectivamente. Los datos sin procesar se guardaron en formato de transmisión de gestión de datos técnicos (TMDS).

Las imágenes in vivo se posprocesaron para mejorar la calidad utilizando LabVIEW 2021. El algoritmo de corrección de fase tenía una precisión limitada cuando se usaba durante la generación de imágenes in vivo debido a los largos tiempos de cálculo necesarios. Solo se utilizó un área de imagen limitada y un número de muestras. Además, el algoritmo fue menos efectivo para imágenes con artefactos de movimiento o bajo contraste, y condujo a errores de cálculo de fase30. Los fotogramas individuales con alto contraste y sin artefactos de movimiento se seleccionaron manualmente para ajustar la fase con un rango de barrido de fase de ±0,75° y un tamaño de paso de 0,01°. Se utilizó el área de imagen completa (p. ej., 1 M de muestras para imágenes grabadas a 10 Hz). Los detalles sobre los parámetros de imagen utilizados para el procesamiento posterior y en tiempo real se resumen en la Tabla S2. Después de la corrección de fase, el ruido de la imagen se redujo aún más utilizando un filtro mediano. El brillo y el contraste se mejoraron aún más mediante la ampliación del histograma y la corrección gamma31.

El estudio clínico fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Michigan Medicine y se realizó en la Unidad de Procedimientos Médicos. El estudio se registró en línea en ClinicalTrials.gov (NCT03220711, fecha de registro: 18/07/2017). Los criterios de inclusión incluyeron pacientes (de 18 a 100 años de edad) previamente programados para una colonoscopia de rutina, con mayor riesgo de cáncer colorrectal y con antecedentes de enfermedad inflamatoria intestinal. Se obtuvo el consentimiento informado de cada sujeto que accedió a participar. Los criterios de exclusión incluyeron pacientes que estaban embarazadas, tenían alergia conocida a la fluoresceína o estaban en quimioterapia activa o radioterapia. Se reclutaron pacientes consecutivos programados para una colonoscopia de rutina para este estudio y representaron la población atendida en Michigan Medicine. El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

Antes del procedimiento, el endomicroscopio se calibró utilizando perlas fluorescentes de 10 μm de diámetro (#F8836, Thermo Fisher Scientific) fijadas en un molde de silicona. Se vertió un sellador de silicona translúcido (#RTV108, Momentive) en un molde de plástico impreso en 3D de 8 cm3. Se dejaron caer perlas fluorescentes acuosas sobre la silicona y se dejaron hasta que se secó el medio acuoso.

Se usó un colonoscopio médico estándar (Olympus, CF-HQ190L) para examinar todo el colon usando iluminación con luz blanca. Una vez que el endoscopista identificó una región sospechosa de enfermedad, el sitio se enjuagó con 5-10 ml de ácido acético al 5 % seguido de agua esterilizada para eliminar la mucosidad y los desechos. Se inyectó una dosis de 5 ml de fluoresceína de 5 mg/ml (Alcon, Fluorescite) por vía intravenosa o se roció tópicamente sobre la mucosa usando una cánula estándar (M00530860, Boston Scientific) que se pasó a través del canal de trabajo.

Se usó un irrigador para lavar cualquier exceso de colorante o residuos en la superficie de la mucosa. Se retiró el catéter de rociado y luego se pasó el endomicroscopio a través del canal de trabajo para recolectar imágenes in vivo. La punta distal se colocó en la región objetivo utilizando una endoscopia de campo amplio como guía. El tiempo total utilizado para recolectar imágenes confocales fue <10 min. Los videos de endoscopia de luz blanca se procesaron con el sistema de imágenes Olympus EVIS EXERA III (CLV-190) y se grabaron con una grabadora de video Elgato HD. Los videos de endomicroscopía se grabaron y guardaron con LabVIEW 2021. Después de completar la imagen, se retiró el endomicroscopio y se usó una pinza de biopsia o una trampa para resecar los tejidos fotografiados. Los tejidos fueron procesados ​​para histología de rutina (H&E) y evaluados por un patólogo GI experto (HDA). Las propiedades espectrales de la fluoresceína se confirmaron con un espectrómetro (USB2000+, Ocean Optics) como se muestra en la Fig. S2.

Los endomicroscopios se esterilizaron después de cada uso en sujetos humanos (Fig. 8). El procedimiento de limpieza se realizó bajo la guía y con la aprobación del Departamento de Control de Infecciones y Epidemiología y el Departamento Central de Reprocesamiento Estéril de Michigan Medicine. Antes del estudio, los instrumentos fueron probados y validados para esterilización por Advanced Sterilization Products (ASP, Johnson & Johnson), una entidad comercial que brinda servicios de validación de esterilización y prevención de infecciones.

Reprocesamiento de instrumentos. (a) El endomicroscopio se colocó en una bandeja después de cada procedimiento para su esterilización con el proceso de reprocesamiento STERRAD. (b) El SMF y los cables se terminaron con conectores de fibra y eléctricos, respectivamente, que se taparon antes del reprocesamiento.

El endomicroscopio se reprocesó utilizando los siguientes pasos: (1) El endomicroscopio se limpió desde el extremo proximal al distal con un paño sin pelusa empapado en detergente enzimático; (2) El instrumento se sumergió en una solución de detergente enzimático durante 3 min, se enjuagó con agua y se secó con un paño sin pelusa. Los conectores eléctricos y de fibra fueron tapados y dejados fuera de la solución; (3) El endomicroscopio se envolvió y colocó en una bandeja de instrumentos para su esterilización con STERRAD 100NX, un sistema de reprocesamiento que utiliza tecnología de plasma de gas de peróxido de hidrógeno a una temperatura relativamente baja y en un entorno de baja humedad durante un ciclo estándar de 47 min.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Descargar referencias

Los autores reconocen el apoyo financiero del Instituto de Innovación Colaborativa de Beijing (BICI), Investigación y Comercialización Traslacional de Michigan (MTRAC) para Ciencias de la Vida y Maiqi Technology Ltd (TDW). Agradecemos a HD Appelman, JM Abraham, S. Bishu, JA Kinnucan, R. Kuick, RS Kwon, RJ Law, NM Sheth, E. Stoffel, MB Sturm, MS Takami, EJ Wamsteker, BR Manoogian, JD Machicado, JA Berinstein, E. Brady, S. Jaiswal, C. Nolan y L. Sitka por el soporte técnico.

Estos autores contribuyeron por igual: Miki Lee y Gaoming Li.

Departamento de Medicina Interna, Universidad de Michigan, Ann Arbor, 48109, EE. UU.

Miki Lee, Gaoming Li, Haijun Li, Xiyu Duan, Danielle K. Turgeon y Thomas D. Wang

Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad de Michigan, Ann Arbor, 48109, EE. UU.

Alcalde B. Birla, Tse-Shao Chang, Kenn R. Oldham y Thomas D. Wang

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Michigan, Ann Arbor, 48109, EE. UU.

Thomas D Wang

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ML, GL, HL, XD, MBB, KRO y TDW diseñaron la tecnología. ML, DKT y TDW concibieron y diseñaron los experimentos. ML, XD, GL, TS.C. y DKT realizaron los experimentos. ML y TDW contribuyeron al análisis de imágenes y datos, y escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Thomas D. Wang.

GL, XD, MB, HL, KO y TDW son inventores de las patentes presentadas por la Universidad de Michigan sobre la tecnología presentada: (1) KRO, TDW, MB, XD Phase Detection and Correction using Image-Based Processing, CN113015881A, 22 Junio ​​de 2021. (2) TDW, HL, XD, GL Endomicroscopio confocal ultracompacto de haz plegado, WO2020191075A1, 24 de septiembre de 2020. (3) TDW, XD, GL, HL Confocal de eje único basado en microsistemas ultracompactos Endomicroscope, WO2020191083A1, 24 de septiembre de 2020. (4) KRO, TDW, MB, XD Phase Detection and Correction using Image-Based Processing, WO2020087015A1, 30 de abril de 2020. ML, TS.C. y DKT declaran no tener intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Lee, M., Li, G., Li, H. et al. Endomicroscopio láser confocal con escáner MEMS distal para histopatología en tiempo real. Informe científico 12, 20155 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24210-9

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Recibido: 26 julio 2022

Aceptado: 11 noviembre 2022

Publicado: 23 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24210-9

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